Tác dụng của chiết xuất (Sa Sâm Việt) Launaea sarmentosa đối với tình trạng viêm do Lipopolysaccharide gây ra thông qua việc ức chế tín hiệu NF-κB/MAPK và kích hoạt Nrf2

Tóm tắt

Launaea sarmentosa đã được sử dụng rộng rãi như một loại thảo mộc dinh dưỡng trong các bài thuốc dân gian của Việt Nam để điều trị nhiều loại bệnh, đặc biệt là các bệnh viêm. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chi tiết nào được tiến hành để kiểm tra các cơ chế phân tử liên quan đến việc ức chế phản ứng viêm. Ở đây, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng của chiết xuất methanol L. sarmentosa đối với tình trạng viêm do lipopolysaccharide (LPS) gây ra bằng cách sử dụng đại thực bào RAW 264.7. Chiết xuất này đã chứng minh hoạt tính chống oxy hóa mạnh do sự hiện diện của các thành phần polyphenolic và flavonoid. Xử lý trước bằng chiết xuất đã ức chế quá trình tiết oxit nitric, các loài oxy phản ứng và yếu tố hoại tử khối u-α do LPS trung gian cũng như biểu hiện của các cytokine gây viêm. Hơn nữa, chiết xuất này đã chặn hoạt động của con đường yếu tố hạt nhân-kappa B và các con đường phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B bằng cách ức chế quá trình phosphoryl hóa Akt. Ngoài ra, con đường protein kinase hoạt hóa bởi mitogen đã bị ức chế và căng thẳng lưới nội chất đã được làm giảm. Hơn nữa, chiết xuất thúc đẩy hoạt động của yếu tố hạt nhân erythroid-2-related factor 2 dẫn đến sự điều hòa tăng của con đường heme oxygenase-1, dẫn đến ức chế stress oxy hóa và phản ứng viêm. Tổng hợp lại, các kết quả cho thấy L. sarmentosa thể hiện tác dụng chống viêm và do đó, có thể được phát triển thêm như một loại thuốc mới để điều trị các bệnh liên quan đến tình trạng viêm quá mức.

1. Giới thiệu

Viêm được mô tả là phản ứng với kích thích có hại bên ngoài trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh hoặc các tín hiệu tổn thương nội sinh, bao gồm cả tổn thương tế bào để phục hồi các chức năng bình thường. Do đó, đây là một quá trình sinh học quan trọng đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì cân bằng nội môi trong cơ thể con người. Tuy nhiên, các quá trình viêm không được kiểm soát sẽ dẫn đến tình trạng biểu hiện quá mức các chất trung gian gây viêm liên quan đến một số bệnh như tiểu đường, bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch, suy tim hoặc ung thư. Việc sử dụng thuốc chống viêm không steroid và steroid là một phương pháp phổ biến để điều trị một số bệnh viêm. Tuy nhiên, các tác dụng phụ có hại liên quan đến độc tính đối với gan và thận cũng như các biến cố tim mạch liên quan đến các phương pháp điều trị như vậy là nguyên nhân gây lo ngại. Do đó, việc phát hiện ra các tác nhân chống viêm mới là điều cần thiết để phát triển một phương pháp điều trị với ít tác dụng phụ liên quan đến việc sử dụng lâu dài. Gần đây, y học thảo dược truyền thống đã thu hút được sự quan tâm và được sử dụng rộng rãi như một nguồn bổ sung và thay thế để điều trị các bệnh viêm. Việc làm sáng tỏ cơ sở phân tử của cơ chế hoạt động của thuốc thảo dược có thể dẫn đến việc sử dụng thuốc thảo dược nhiều hơn để điều trị nhiều bệnh liên quan đến tình trạng viêm mãn tính.

Launaea sarmentosa (Willd.) Schultz-Bip.ex Kuntze đồng nghĩa Launaea pinnatifida (Cass.), một loại thảo mộc bò, được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc truyền thống của Việt Nam để điều trị nhiều bệnh, chẳng hạn như bệnh gút, nhiễm trùng tiết niệu và chấn thương da. Dựa trên các bài thuốc của Việt Nam, L. sarmentosa thường được sử dụng như một loại rau bổ dưỡng hoặc bổ sung vào sữa mẹ sau khi sinh con. Các phân tích hóa thực vật trước đây về L. sarmentosa đã xác nhận sự hiện diện của ancaloit, carbohydrate, axit amin, steroid, glycoside, flavonoid, v.v. Các hợp chất như vậy thể hiện hoạt động chống viêm, chống oxy hóa và bảo vệ gan. Gần đây, có báo cáo rằng điều trị bằng chiết xuất methanol của L. sarmentosa dẫn đến giảm phản ứng viêm ở mô hình chuột thụt rửa chân sau bằng Carrageenan. Tuy nhiên, cơ chế tác dụng chống viêm của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ.

Các kích thích gây viêm, chẳng hạn như lipopolysaccharide (LPS), dẫn đến hoạt hóa các đại thực bào. Sự kích thích này khởi đầu phản ứng sinh học dẫn đến sản xuất quá mức các chất trung gian gây viêm như oxit nitric, cyclooxygenase, yếu tố hoại tử khối u-α. Do đó, biểu hiện của các cytokine tiền viêm hoặc chất trung gian gây viêm được sử dụng để đánh giá tác động của các tác nhân dược lý lên các quá trình viêm. Trong phản ứng viêm do LPS kích thích, sự hoạt hóa của con đường nhân tố hạt nhân-kappa B (NF-κB) và con đường protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) có thể điều chỉnh biểu hiện của các cytokine tiền viêm và các yếu tố trung gian. Ngoài ra, stress oxy hóa do quá trình viêm được biết là làm tăng mức độ ROS nội bào và điều chỉnh biểu hiện của các enzym chống oxy hóa cũng như chống lại tổn thương oxy hóa để bảo vệ các mô. Sự điều hòa các gen mã hóa các enzym giải độc pha II, đặc biệt là heme oxygenase-1 (HO-1), được điều chỉnh bởi sự chuyển vị hạt nhân của yếu tố liên quan đến yếu tố hạt nhân-erythroid-2 (Nrf2) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa và viêm nhiễm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá cơ chế mà L. sarmentosa phát huy các đặc tính bảo vệ của nó trong quá trình viêm do LPS gây ra ở các dòng tế bào đại thực bào chuột (đại thực bào RAW 264.7). Chúng tôi đã chứng minh rằng chiết xuất methanol L. sarmentosa (Ls-ME) có thể làm giảm hoạt động của NF-κB/MAPK liên quan đến con đường PI3K/Akt và thúc đẩy con đường truyền tín hiệu Nrf2/HO-1. Do đó, chúng tôi tin rằng L. sarmentosa có thể được thêm vào danh sách các ứng cử viên chống viêm thiết yếu sẽ được phát triển như một phương pháp điều trị tiềm năng.

Kết quả

3.1. Hoạt động chống oxy hóa của Ls-ME

Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất methanol của L. sarmentosa (Ls-ME) đã được kiểm tra bằng cách đánh giá tác dụng dọn gốc DPPH của nó (dữ liệu không được hiển thị). Hoạt tính dọn gốc tự do tăng tuyến tính khi nồng độ Ls-ME tăng. Giá trị SC ₅₀ của Ls-ME, tương ứng với nồng độ cần thiết để dọn 50% gốc tự do trong mẫu, được quan sát thấy là 26,7 μg/mL (tương đương với 5,5 μg/mL vitamin C). Ngoài ra, tổng lượng polyphenol và flavonoid được quan sát thấy lần lượt là 258,2 ± 0,78 mg GAE/g chiết xuất khô và 71,2 ± 0,37 mg QE/g chiết xuất khô. Ngoài ra, tổng hàm lượng polysaccharide trong Ls-ME được quan sát thấy là 0,11% ( w/w ). Những kết quả này chứng minh rằng Ls-ME có thể dọn gốc tự do hiệu quả.

3.2. Tác động của Ls-ME lên khả năng sống của đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS

Trước khi thử nghiệm chống viêm, độc tính tế bào của Ls-ME đối với đại thực bào RAW 264.7 được đánh giá bằng cách kiểm tra sự sống còn của tế bào khi có hoặc không có LPS. Bước này được thực hiện để tìm ra nồng độ Ls-ME tối ưu có độc tính tối thiểu. Không quan sát thấy tác dụng đáng kể nào đối với sự sống còn của tế bào khi điều trị bằng Ls-ME với nồng độ lên tới 800 µg/mL. Thông thường, lượng LDH được giải phóng từ tế bào chết là chỉ số được sử dụng để đánh giá độc tính tế bào. Nồng độ LDH không tăng trong môi trường khi điều trị bằng Ls-ME. Những kết quả này cho thấy Ls-ME không gây ra hoạt động gây độc tế bào với nồng độ lên tới 800 µg/mL. 

Hình 1.  

Tác động của Ls-ME lên khả năng sống và hình thái của tế bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS. Các tế bào được xử lý bằng nhiều nồng độ Ls-ME khác nhau trong 24 giờ. ( A ) Khả năng sống của tế bào và ( B ) Hoạt động LDH đã được kiểm tra. Hoạt động LDH trong chiết xuất toàn tế bào (WCE) được biểu thị là hoạt động 100% và được sử dụng làm đối chứng. Tác động của Ls-ME lên khả năng sống của tế bào sau khi kích thích LPS được chứng minh trong ( C ). Hình thái của tế bào được kiểm tra trong ba nhóm: nhóm không được xử lý chỉ bằng môi trường, nhóm được xử lý bằng LPS (LPS-1 µg/mL) trong 18 giờ và nhóm tiền xử lý Ls-ME + LPS (Ls-ME 200 μg/mL trong 24 giờ) (kích thích LPS được thực hiện trong 18 giờ). Hình thái của các tế bào được thể hiện trong ( D ). Kết quả được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD (n = 6). Thanh tỷ lệ biểu thị 10 µm trong ( D ); ^# p < 0,05; ns, không đáng kể khi so sánh với nhóm không được xử lý.

Trong quá trình kích thích LPS, khả năng sống của tế bào bị giảm, như đã báo cáo trước đây. Tác dụng của tiền xử lý bằng Ls-ME tiếp theo là kích thích LPS cũng đã được nghiên cứu. Như mong đợi, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể khi kích thích bằng LPS so với nhóm không được xử lý. Tiền xử lý bằng Ls-ME đã ngăn chặn sự giảm khả năng sống của tế bào. Về mặt hình thái của đại thực bào được hoạt hóa, nhóm được xử lý bằng LPS biểu hiện hình dạng thay đổi so với nhóm không được xử lý. Các tế bào vẫn giữ nguyên hình dạng tròn ban đầu trong nhóm được xử lý bằng Ls-ME mặc dù đã kích thích bằng LPS. Những kết quả này chứng minh rằng Ls-ME không biểu hiện độc tính tế bào và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do LPS gây ra.

3.3. Ls-ME làm giảm sản xuất NO, ROS và TNF-α

Vì NO và ROS là những chất trung gian gây viêm nổi tiếng đóng vai trò thiết yếu trong quá trình viêm, nên tác động của Ls-ME lên phản ứng viêm do LPS gây ra ở tế bào RAW 264.7 đã được nghiên cứu bằng cách phát hiện nồng độ NO và sản xuất ROS nội bào. Việc tạo ra NO được tăng cường đáng kể để đáp ứng với sự kích thích bằng LPS. Tuy nhiên, xử lý trước bằng Ls-ME đã ức chế đáng kể việc sản xuất NO. Hơn nữa, sản xuất ROS được điều chỉnh tăng lên khi kích thích bằng LPS, trong khi giảm đáng kể khi xử lý trước bằng Ls-ME.

Hình 2. 

Hiệu ứng ức chế của Ls-ME đối với sản xuất NO, ROS và TNF-α do LPS gây ra ở đại thực bào RAW 264.7. Các tế bào được nuôi cấy với nồng độ Ls-ME nối tiếp trong 24 giờ, sau đó được xử lý bằng LPS (1 µg/mL) trong 18 giờ. Nồng độ NO trong các tế bào được kích thích bằng LPS được đo bằng xét nghiệm Griess ( A ). Nồng độ NO quan sát thấy sau khi xử lý trước bằng L-NAME ở nồng độ 100 µM được sử dụng làm đối chứng dương tính. Sự tích tụ ROS nội bào được đánh giá ( B ). Sản xuất TNF-α trong các tế bào được xử lý bằng LPS được xác định bằng ELISA ( C ). Dữ liệu thu được từ ba lần lặp lại được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. ^# p < 0,05 được biểu thị khi so sánh với các tế bào được ủ riêng; * p < 0,05; *** p < 0,001 và **** p < 0,0001 được biểu thị khi so sánh với chỉ xử lý bằng LPS.

Ngoài ra, nồng độ cytokine tiền viêm dưới dạng TNF-α đã được phân tích bằng ELISA. Sự gia tăng sản xuất TNF-α đã được chứng minh trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS, trong khi nó bị ức chế đáng kể khi xử lý trước bằng Ls-ME. Nhìn chung, những phát hiện này chỉ ra rằng Ls-ME ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm và cytokine trong các tế bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS. Dựa trên những kết quả này, nồng độ Ls-ME 50–200 µg/mL đã được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo để đánh giá thêm cơ chế cơ bản của tác dụng chống viêm của nó.

3.4. Ls-ME ức chế sự biểu hiện của các gen gây viêm

Để kiểm tra vai trò bảo vệ của Ls-ME, tiếp theo chúng tôi kiểm tra mức độ phiên mã của iNOS ( NOS2 ), COX-2 , IL-6 và IL-1β bằng phân tích RT-qPCR. Như mong đợi, biểu hiện mRNA của các gen tiền viêm này được điều chỉnh tăng lên khi kích thích LPS so với nhóm đối chứng, trong khi điều trị trước bằng Ls-ME làm giảm đáng kể mức mRNA tăng lên của các cytokine đã đề cập ở trên. Kết quả của chúng tôi cho thấy Ls-ME ức chế mức mRNA của các gen tiền viêm, do đó làm giảm tình trạng viêm.

Hình 3. 

Hoạt động ức chế của Ls-ME đối với biểu hiện mRNA do LPS gây ra tương ứng với các gen tiền viêm trong đại thực bào RAW 264.7. Các tế bào được nuôi cấy với nồng độ Ls-ME nối tiếp trong 24 giờ, sau đó được xử lý bằng LPS (1 µg/mL) trong 18 giờ. Mức mRNA của các gen iNOS ( A ), COX-2 ( B ), IL-6 ( C ) và IL-1β ( D ) được xác định bằng RT-qPCR. Dữ liệu của ba bản sao được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. ^# p < 0,05 được biểu thị khi so sánh với các tế bào được ủ riêng lẻ; **** p < 0,0001 được biểu thị khi so sánh với chỉ xử lý LPS; ns, không đáng kể.

3.5. Ls-ME làm giảm sự kích hoạt của các con đường NF-ĸB/PI3K/Akt

NF-κB và con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt điều hòa thượng nguồn của nó được kích hoạt trong quá trình viêm và thúc đẩy biểu hiện các chất trung gian gây viêm. Dựa trên các kết quả đã đề cập ở trên, chúng tôi tiếp tục khám phá xem liệu tác dụng của Ls-ME đối với tình trạng viêm do LPS gây ra có được quan sát thấy do ảnh hưởng của nó đối với các con đường truyền tín hiệu NF-κB và PI3K/Akt hay không bằng cách sử dụng phân tích Western blot. Như được minh họa trong, sự gia tăng mức độ biểu hiện của p-Akt và p-IκBα đã bị ức chế đáng kể khi xử lý trước bằng Ls-ME.

Hình 4. 

Hoạt động ức chế của Ls-ME đối với sự hoạt hóa các con đường NF-κB/PI3K/Akt trong đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS. Các tế bào được nuôi cấy với nồng độ Ls-ME nối tiếp trong 24 giờ, sau đó được xử lý bằng LPS (1 µg/mL) trong 18 giờ. Phân tích Western blot xác định biểu hiện của tổng Akt, IκB α và p-Akt đã phosphoryl hóa, p-IĸB α ( A ). Các phân đoạn tế bào chất và nhân được tách trong dung dịch ly giải toàn bộ tế bào để phân tích p65 (C, tế bào chất) và p65 (N, nhân). Cường độ dải tương đối của p-IκBα đến IκBα và của p-Akt đến Akt được định lượng ( B ). Cường độ dải tương đối của p65 (C, tế bào chất) và p65 (N, nhân) được định lượng ( C ). Cường độ dải tương đối được phân tích bằng Image J. Hình ảnh đại diện được hiển thị trong ( D ) với màu xanh lá cây của Alexa-488. Kiểm soát, các tế bào được ủ riêng; LPS, các tế bào được ủ với LPS; Ls-ME + LPS, các tế bào được ủ với Ls-ME (200 µg/mL), sau đó được xử lý bằng LPS. Cường độ huỳnh quang được phân tích bằng MetaMorph ( n = 35) ( E ). Thanh tỷ lệ chỉ ra 50 µm. Dữ liệu của ba bản sao được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. ^# p < 0,05 được biểu thị khi so sánh với các tế bào được ủ riêng; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 được biểu thị khi so sánh với chỉ xử lý LPS.

Ngoài ra, LPS tăng cường sự chuyển vị hạt nhân của tiểu đơn vị p65. Tuy nhiên, mức độ tiểu đơn vị p65 trong nhân giảm đáng kể sau khi điều trị bằng Ls-ME (50–200 µg/mL) trước khi kích thích LPS. Hơn nữa, tiểu đơn vị NF-κB p65 được hình dung bằng cách sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang để xác nhận vị trí của nó dưới ảnh hưởng của Ls-ME. Phù hợp với những phát hiện này, kết quả ngụ ý rằng vị trí của tiểu đơn vị p65 do LPS kích hoạt đã bị suy yếu sau khi điều trị bằng Ls-ME. Do đó, kết quả của chúng tôi cho thấy Ls-ME có khả năng ức chế hoạt hóa NF-κB/PI3K/Akt.

3.6. Ls-ME ức chế sự kích hoạt của con đường truyền tín hiệu MAPK

Trong quá trình viêm, sự hoạt hóa của họ MAPK, bao gồm kinase ½ được điều hòa bởi tín hiệu ngoại bào (ERK½), kinase đầu c-Jun amino (N)-terminal (JNK) và p38 MAPK, cũng đóng vai trò điều biến thiết yếu trong quá trình thích nghi và khởi tạo phiên mã các chất trung gian gây viêm. Phân tích Western blot chứng minh rằng kích thích LPS kích hoạt quá trình phosphoryl hóa ERK½, JNK và p38 MAPK, trong khi quá trình phosphoryl hóa của chúng bị ức chế hiệu quả khi xử lý trước bằng Ls-ME. Kết quả chỉ ra rằng Ls-ME có thể làm trung gian cho hoạt động chống viêm do tác dụng ức chế của nó đối với quá trình phosphoryl hóa MAPK.

Hình 5. 

Hoạt động ức chế của Ls-ME trên con đường truyền tín hiệu phosphoryl hóa MAPK do LPS gây ra ở đại thực bào RAW 264.7. Các tế bào được nuôi cấy với nồng độ Ls-ME nối tiếp trong 24 giờ, sau đó được xử lý bằng LPS (1 µg/mL) trong 18 giờ. Biểu hiện của tổng p38, JNK, ERK½ và p-p38, p-JNK, p-ERK½ đã phosphoryl hóa đã được kiểm tra bằng phương pháp phân tích Western blot ( A ). Cường độ băng tần tương đối đã được phân tích bằng Image J ( B ). Dữ liệu của ba bản sao được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. ^# p < 0,05 được biểu thị khi so sánh với các tế bào được ủ riêng lẻ; **** p < 0,0001 được biểu thị khi so sánh với chỉ xử lý bằng LPS.

3.7. Ls-ME ức chế căng thẳng ER

Căng thẳng lưới nội chất (ER) là một yếu tố tiềm ẩn có thể làm trầm trọng thêm phản ứng viêm và protein đồng đẳng C/EBP (CHOP) là một trong những dấu hiệu quan trọng để xác định tác động của căng thẳng ER. Ngoài ra, sự suy giảm mRNA của protein liên kết hộp X1 (XBP-1), một thành phần quan trọng của căng thẳng ER, cho thấy sự ức chế đáng kể biểu hiện của các chất trung gian gây viêm. Để đánh giá tác động của Ls-ME đối với căng thẳng ER, chúng tôi đã đo mức mRNA của CHOP và XBP-1 bằng RT-qPCR. Như minh họa trong , mức mRNA của CHOP , XBP-1 được tăng cường để đáp ứng với kích thích LPS. Tuy nhiên, các mức này đã giảm đáng kể khi xử lý trước bằng Ls-ME. Những kết quả này chứng minh rằng Ls-ME làm giảm căng thẳng ER do kích thích bằng LPS gây ra ở đại thực bào RAW 264.7.

Hình 6. 

Ls-ME ức chế biểu hiện CHOP ( A ) và XBP-1 ( B ) trong tế bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS. Các tế bào được nuôi cấy với nồng độ Ls-ME nối tiếp trong 24 giờ, sau đó được xử lý bằng LPS (1 µg/mL) trong 18 giờ. Mức mRNA của CHOP , XBP-1 được phân tích bằng RT-qPCR. Dữ liệu của ba bản sao được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. ^# p < 0,05 được biểu hiện khi so sánh với các tế bào được ủ riêng lẻ; ** p < 0,01; **** p < 0,0001 được biểu hiện khi so sánh với chỉ xử lý bằng LPS; ns, không đáng kể.

3.8. Ls-ME thúc đẩy sự kích hoạt Nrf2/HO-1

Sự biểu hiện gen mã hóa chất chống oxy hóa qua trung gian Nrf2 làm giảm sản xuất ROS và góp phần vào tác dụng chống viêm. Chúng tôi tiếp tục đánh giá xem con đường Nrf2/HO-1 có liên quan đến tác dụng chống oxy hóa của Ls-ME hay không. Đầu tiên, kết quả của Western blot với protein hạt nhân chỉ ra rằng Ls-ME thúc đẩy sự chuyển vị hạt nhân Nrf2 và điều chỉnh tăng hiệu quả mức HO-1. Hơn nữa, nhuộm miễn dịch cho thấy sự định vị tăng cường của Nrf2 trong nhân. Xét về tổng thể, những phát hiện này chứng minh rằng Ls-ME phát huy hoạt động chống viêm của nó bằng cách gây ra sự hoạt hóa Nrf2/HO-1.

Hình 7. 

Ls-ME thúc đẩy hoạt hóa Nrf2/HO-1. Các tế bào được nuôi cấy với nồng độ Ls-ME nối tiếp trong 24 giờ, sau đó xử lý bằng LPS (1 µg/mL) trong 18 giờ. Biểu hiện của Nrf2 trong các phân đoạn cytosol (C) và nhân (N), và HO-1 trong dịch phân hủy toàn bộ tế bào được xác định bằng phương pháp Western blot ( A ). Cường độ dải tương đối của Nrf2/ β-actin, Nrf2 (N)/lamin B1 ( B ) và HO-1/lamin B1 ( C ) được định lượng bằng Image J. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường chỉ (kiểm soát), chỉ LPS (1 µg/mL) hoặc Ls-ME (200 µg/mL) sau đó là LPS (1 µg/mL) và được nhuộm bằng kháng thể Nrf2 được gắn nhãn bằng Alex Fluor 594 (màu đỏ) và DAPI (màu xanh). Hình ảnh đại diện được hiển thị trong ( D ) với màu đỏ của Alexa-594. Kiểm soát, các tế bào được ủ riêng; LPS, các tế bào được ủ với LPS; Ls-ME + LPS, các tế bào được ủ với Ls-ME (200 µg/mL), sau đó được xử lý bằng LPS. Cường độ huỳnh quang được phân tích bằng MetaMorph ( n = 35) ( E ). Thanh tỷ lệ chỉ ra 50 µm. Dữ liệu của ba bản sao được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. ^# p < 0,05 được biểu thị khi so sánh với các tế bào được ủ riêng; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 được biểu thị khi so sánh với chỉ xử lý LPS; ns, không đáng kể.

4. Thảo luận

Nhiều bài thuốc thảo dược đã được ghi nhận có lợi ích lâm sàng rõ rệt đối với sức khỏe tổng thể và/hoặc phòng ngừa các bệnh viêm nhiễm. Đáng chú ý, bằng chứng dịch tễ học cho thấy các loại thảo dược truyền thống là nguồn tiềm năng của liệu pháp chống viêm mới phát huy hoạt tính sinh học với ít tác dụng phụ độc hại hơn . L. sarmentosa trước đây đã được báo cáo là có tác dụng dược lý, cho thấy tiềm năng của nó trong việc điều trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là tình trạng viêm. Tuy nhiên, vẫn cần phải xem xét cơ chế hoạt động chi tiết và toàn diện đằng sau các đặc tính dược lý và thành phần hóa học của nó. Chúng tôi quan sát thấy rằng Ls-ME bao gồm một lượng lớn polyphenol (258,2 ± 0,78 mg GAE/g chiết xuất khô); tuy nhiên, một lượng tương đối nhỏ flavonoid (71,2 ± 0,37 mg QE/g chiết xuất khô) và polysaccharides (0,11%) đã được quan sát thấy, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Những kết quả này có thể là do thực tế là hầu hết các thành phần polyphenol trong chiết xuất là các hợp chất không phải flavonoid. Polyphenol, flavonoid và polysaccharide là những chất chính góp phần vào quá trình chống oxy hóa. Ls-ME đã chứng minh hoạt động dọn gốc DPPH cao (SC ₅₀ : 26,7 µg/mL). Kết quả này chỉ ra rằng tính chất chống oxy hóa có thể là do hàm lượng polyphenolic cao. Tính chất chống oxy hóa của L. sarmentosa tương đối mạnh hơn tính chất chống oxy hóa của các chiết xuất thực vật khác. Một nghiên cứu gần đây đã quan sát thấy rằng Anacyclus clavatus là một loại thảo mộc có khả năng chống viêm với hàm lượng phenolic và flavonoid thấp hơn so với L. sarmentosa. Nhìn chung, những kết quả này chỉ ra rằng L. sarmentosa cần được đánh giá thêm ở cấp độ khoa học và về tiềm năng của nó trong các ứng dụng điều trị.

Chất chống oxy hóa (polyphenol và flavonoid) có thể dọn sạch các gốc tự do, do đó ức chế tổn thương oxy hóa đối với các cấu trúc tế bào. Do đó, chất chống oxy hóa đã được khám phá như các tác nhân hoạt động để bảo vệ tế bào chống lại tình trạng viêm. Đặc biệt, vai trò của stress oxy hóa do LPS gây ra đã được chứng minh trong quá trình kiểm tra các quá trình viêm, đặc biệt là trong giai đoạn bắt đầu hoặc tiến triển. Kết quả đánh giá khả năng sống của tế bào và quan sát hình thái chỉ ra rằng Ls-ME bảo vệ tế bào khỏi tổn thương tế bào do LPS gây ra. Hơn nữa, kết quả của chúng tôi chứng minh rằng Ls-ME ức chế đáng kể các chất trung gian gây viêm thiết yếu trong quá trình kích thích LPS, chẳng hạn như sản xuất NO, ROS, TNF-α. Để đáp ứng với các chất kích thích điển hình như LPS sau khi nhiễm trùng, các tế bào miễn dịch tiết ra NO và các sản phẩm khác để đáp ứng với tình trạng viêm. Nồng độ NO quá mức có thể dẫn đến các bệnh viêm. Sự biểu hiện quá mức của iNOS là nguyên nhân chính gây ra tình trạng tiết NO quá mức. Trong nghiên cứu này, Ls-ME ức chế đáng kể quá trình tiết NO và biểu hiện của iNOS, chứng minh phản ứng chống viêm hiệu quả. Ngoài ra, các tế bào miễn dịch cũng giải phóng prostaglandin E2 (PGE ₂ ), được sản xuất bởi COX-2 trong quá trình viêm. Đúng như dự đoán, Ls-Me ức chế hiệu quả biểu hiện của COX-2. Do đó, những kết quả này chỉ ra rằng Ls-ME có thể làm giảm một số triệu chứng viêm. Bên cạnh đó, biểu hiện của các cytokine tiền viêm (IL-6, IL-1β) được tăng cường trong quá trình phản ứng miễn dịch. Ls-ME làm giảm đáng kể biểu hiện tăng lên của IL-6 và IL-1β. IL-6 là một chất trung gian hòa tan có tác dụng đa hình đối với phản ứng viêm, phản ứng miễn dịch và tạo máu. Người ta đã quan sát thấy biểu hiện tăng cao của IL-1β ở nhiều loại ung thư của con người. Dựa trên những phát hiện này, nghiên cứu sâu hơn sẽ làm sáng tỏ cơ chế phân tử của hoạt động chống viêm của L. sarmentosa để phát triển các loại thuốc mới.

LPS kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh bằng cách liên kết với thụ thể giống Toll-4 (TLR-4), dẫn đến kích hoạt chuỗi tín hiệu, bao gồm con đường NF-κB. Khi NF-κB được kích hoạt, sự chuyển vị của các tiểu đơn vị NF-κB được tăng cường, dẫn đến phản ứng viêm. Trong các tế bào không được kích thích, NF-κB tồn tại dưới dạng dị hợp tử bao gồm các tiểu đơn vị p50/p65 và được cô lập trong tế bào chất bởi các IκB cụ thể. LPS có thể kích hoạt quá trình phosphoryl hóa IκBα dẫn đến sự phân hủy của nó, cho phép NF-κB chuyển vị vào nhân, nơi nó kích hoạt phiên mã của các gen. Kết quả của chúng tôi chứng minh rằng Ls-ME ức chế đáng kể quá trình phosphoryl hóa IκBα, dẫn đến ức chế vị trí của tiểu đơn vị p65 NF-κB khi được kích thích bằng LPS trong đại thực bào RAW 264.). Các cytokine tiền viêm cũng gây ra biểu hiện của các gốc tự do như NO, ROS. Ngoài ra, các gốc tự do quá mức có thể gây ra stress oxy hóa; do đó, các gốc tự do có thể ức chế hoặc kích hoạt các chuỗi tín hiệu. Do đó, việc giảm biểu hiện của các gốc tự do như NO, ROS bởi Ls-ME có thể ảnh hưởng đến hoạt hóa NF-κB.

Sự hoạt hóa NF-κB được thúc đẩy bởi nhiều loại protein kinase tế bào, đặc biệt là MAPK (p38, ERK, JNK) và PI3K/Akt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm. Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng sự hoạt hóa Akt trong các tế bào được kích thích bởi LPS hoạt động như một chất điều hòa thượng nguồn của NF-κB trong các tế bào microglia. Ngoài ra, một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng sự kích thích của LPS có thể dẫn đến sự phosphoryl hóa MAPK trong đại thực bào. Akt lần đầu tiên được biểu diễn bằng chức năng của nó trong việc điều hòa sự biệt hóa và tăng sinh tế bào. Nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng Ls-ME ức chế sự phosphoryl hóa Akt và sự hoạt hóa MAPK do LPS gây ra.

Một số sự kiện tế bào được trung gian bởi kích thích LPS có thể kích hoạt một số con đường truyền tín hiệu dẫn đến sản xuất ROS và căng thẳng ER. Để đánh giá khả năng kích hoạt của các con đường, quá trình sản xuất căng thẳng ER đã được kiểm tra bằng cách phân tích mức độ biểu hiện của CHOP và XBP-1 hoạt động như các dấu hiệu căng thẳng ER liên quan đến cơ chế sinh bệnh trong tình trạng viêm. Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng p38 MAPK kích hoạt biểu hiện CHOP trong các tế bào bị căng thẳng. Điều thú vị là Endo et al. đã chỉ ra rằng căng thẳng ER được kích hoạt bởi kích thích LPS, tiếp theo là sự biểu hiện quá mức của CHOP trong phản ứng căng thẳng ER. Nó cũng kích hoạt p38, trung gian cho quá trình apoptosis. Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh rằng biểu hiện của CHOP và XBP-1 được tăng cường khi kích thích LPS, trong khi tác dụng của LPS bị ức chế đáng kể bởi Ls-ME. Nhìn chung, những phát hiện này củng cố giả thuyết của chúng tôi rằng L. sarmentosa phát huy tác dụng chống viêm bằng cách ngăn chặn các con đường truyền tín hiệu NF-κB/MAPK/PI3K/Akt để làm giảm căng thẳng ER gây ra ở đại thực bào RAW 264.7 khi được kích thích bởi LPS.

Căng thẳng oxy hóa được quan sát thấy trong quá trình kích thích LPS, dẫn đến hoạt hóa đại thực bào và phản ứng viêm mạnh. Do đó, chúng tôi đã đánh giá tác dụng chống căng thẳng oxy hóa của Ls-ME ở đại thực bào được kích thích bằng LPS. Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng hoạt hóa Nrf2 và con đường truyền tín hiệu chống oxy hóa có thể ngăn chặn sự điều hòa tăng phiên mã của các gen, chẳng hạn như IL-6, do LPS gây ra. Hơn nữa, hoạt hóa Nrf2 làm giảm sản xuất ROS bằng cách trung gian biểu hiện của các gen mã hóa chất chống oxy hóa. Kết quả của chúng tôi cho thấy Ls-ME ức chế đáng kể sự gia tăng tổn thương tế bào, sản xuất ROS và mức độ biểu hiện IL-6 do LPS gây ra  cho thấy Ls-ME có thể gây ra căng thẳng oxy hóa và tác dụng chống viêm bằng cách thúc đẩy hoạt động của con đường Nrf2. Nrf2 xuất hiện trong tế bào chất khi nó liên kết với protein liên kết với ECH giống Kelch (Keap1) trong điều kiện bình thường. Tuy nhiên, sự chuyển vị của nó có thể biểu hiện tác động lên phản ứng stress oxy hóa và điều chỉnh tăng mức độ của các enzym chống oxy hóa, đặc biệt là HO-1. Chúng tôi quan sát thấy rằng xử lý trước bằng Ls-ME đã tăng cường sự chuyển vị hạt nhân của Nrf2 khi kích thích LPS. Chúng tôi tin rằng việc tăng cường phản ứng phụ thuộc vào Nrf2 có thể là mục tiêu tiềm năng để ngăn ngừa tình trạng viêm và stress oxy hóa. HO-1 là một trong những chất trung gian hiệu quả liên quan đến phản ứng viêm phụ thuộc vào sự hoạt hóa của Nrf2. Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh rằng mức độ HO-1 được tăng cường bởi Ls-ME. Những phát hiện này minh họa rằng Ls-ME có thể thúc đẩy hoạt động của con đường truyền tín hiệu Nrf2/HO-1 để điều chỉnh tăng mức HO-1, do đó làm giảm sản xuất ROS. Những phát hiện này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của chúng tôi chỉ ra rằng chiết xuất lá Lasia spinosa ức chế tình trạng viêm do kích thích LPS gây ra thông qua việc kích hoạt Nrf2/HO-1. Polyphenol và flavonoid có thể ảnh hưởng đến các con đường chống viêm và chống oxy hóa bằng cách điều chỉnh các yếu tố phiên mã như NF-κB, Nrf2. Ngoài ra, sự hiện diện của các thành phần khác như polysaccharides, terpenes và terpenoid trong Ls-ME cũng có thể ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của nó. Do đó, hoạt hóa Nrf2/HO-1 cũng có thể được điều chỉnh bởi các thành phần này.

Tóm lại, chúng tôi đã chứng minh rằng Ls-ME ức chế các chất trung gian gây viêm bằng cách ức chế con đường NF-κB/MAPK/PI3K/Akt và thúc đẩy hoạt hóa con đường truyền tín hiệu Nrf2/HO-1 trong đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS. Ngoài ra, Ls-ME có thể làm giảm căng thẳng ER, dẫn đến giảm mức CHOP và XBP-1. Những phát hiện của chúng tôi cung cấp bằng chứng ban đầu về cơ chế cơ bản của tác dụng chống viêm của L. sarmentosa và làm nổi bật tiềm năng của nó như một tác nhân trị liệu thực vật. Cần nghiên cứu thêm để phân lập các hợp chất hoạt tính và đánh giá tác dụng của nó đối với tình trạng viêm./.